La parte interna della chiesa è veramente affascinante: a croce latina, con tre ampie navate su pilastri polistili che reggono le volte azzurre con stelle d'oro. Il meraviglioso pavimento marmoreo accentua l'effetto suggestivo della bicromia delle fasce bianche e nere che domina la chiesa. Il pavimento è molto particolare con i suoi 56 riquadri a graffito, eseguiti tra il 1369 e il 1547, che raffigurano scene sacre e profane, ad opera di oltre 40 artisti tra cui il Beccafumi che ne realizzò ben 35. Dove si trovano i primi pilastri della navata centrale sono situate due raffinate acquasantiere di Antonio Federighi e verso la fine della navata destra , dove si trova la porticina del campanile, vi è il monumento funerario del vescovo Tommaso Piccolomini del Testa, ad opera di Neroccio di Bartolomeo.
La cupola è abbellita da sei statue dorate di santi, dominate da una galleria cieca con 42 patriarchi e profeti. Nel transetto destro vi stupirà la cappella barocca della Madonna del Voto del grande Gian Lorenzo Bernini, artefice anche di due statue marmoree poste ai lati dell'ingresso. Sull'altare si trova in tutto il suo splendore la duecentesca Madonna del Voto, della scuola di Guido da Siena. Al secondo altare del transetto potrete ammirare la Predica di S. Bernardino, prezioso capolavoro del caravaggesco Mattia Preti. Nell'abside non perdetevi lo splendido coro ligneo con specchi intarsiati di Fra' Giovanni da Verona. Volgendo lo sguardo in alto noterete la vetrata circolare con storie della Vergine, una delle più antiche vetrate piombate di creazione italiana, realizzata su disegno di Duccio.
Nel transetto sinistro potrete apprezzare il rinomato pergamo in marmo bianco, a pianta ottagonale, ad opera di Nicola Pisano. Alle spalle del pergamo si apre la cappella di S. Ansano, con il monumento funebre del cardinale Riccardo Petroni, opera di stile gotico di Tino di Camaino, mentre nel pavimento vi è la lastra tombale del vescovo Giovanni Pecci, capolavoro in bronzo di Donatello. All'altare invece vi è S. Ansano che battezza il popolo senese di Francesco Vanni. Sul cominciare del transetto sinistro evidenziamo la cappella di S. Giovanni Battista, di età rinascimentale, ad opera di Giovanni di Stefano, con la statua di S. Giovanni Battista, energico bronzo di Donatello, e i dipinti del Pinturicchio dell'inizio del '500.
